سنجش انزایم پلی گالاکتوروناز (انزایم پکتینولیتیکی PG )

    انزایم پلی گالاکترونیز بخش بزرگی از انزایمی را که به عنوان پکتینیز (پکتیناز) می شناسیم تشکیل میدهد.  روش های زیادی برای سنجش این انزایم پیشناهد و به کار برده شده که روش سنجش با اسپکتوفوتومتر به روش سنجش قندهای احیا یکی از عمومی ترین و پرکاربرد ترین آنهاست.

    متد سنجش قندهای احیا به روش DNS یا دی نیترو سالیسیلیک اسید قند های آزاد و احیا کننده موجود در محیط را اندازه میگیرد. برمبنای اینروش این قندهای ازاد شده در محلول با DNS واکنش داده و رنگ قهوه ای تولید میکنند. انزایم هایی که آنها را به عنوان پکتینیز ( Pectinase ) می شناسیم پکتین را به قندهایی کوچک می شکنند و بر این مبنا در صورتی که سوبسترای سنجش پکتین باشد می توان فعّالیّت آنها را با DNS سنجید.

روش کار بدین صورت است که به 5/0 میلی لیتر محلول پکـتین 7/0 درصد در بافر استات 1/0مولار (2/4 : pH )، 20 میکرولیتر محلول حاوی انزایم اضافه کرده و در انکوباتور دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرما گذاری می نمائیم. پس از گذشت مدت 7 دقیقه، 5/0 میلی لیتر محلول سود 5/0 نرمال به آن اضافه کرده و محتویات را بخوبی مخلوط می نمائیم. سپس به آن 200 میکرولیتر محلول معرف DNS  می افزاییم. حاصل را در آب جوش به مدت 10 دقیقه قرار داده تا در اثر واکنش گروههای احیا کننده با معرف DNS ، تغییر رنگ از زرد روشن تا قهوه ای انجام پذیرد.

   بدیهی است هرچه فعالیت انزایمی بالاتر باشد، قندها و گروههای احیا کننده نیز بیشتر بوده و شدت رنگ قهوه ای بیشتر خواهد بود. در صورت لزوم نمونه ها را با مقدار مشخصی آب مقطر رقیق کرده و سپس جذب نوری نمونه ها را در طول موج 550 نانومتر قرائت می کنیم. مقادیر جذب نوری بدست آمده با شاهد مقایسه میشوند.

    فعالیت انزایمی را بر حسب واحد در هر میلی لیتر نمونه انزایمی با کمک منحنی استاندارد بدست می‌آوریم. جهت بدست آوردن منحنی استاندارد ، تست DNS  را برای غلظتهای مختلف اسید گالاکتورونیک، انجام می دهیم.

    یک واحد انزایمی مقدار انزایمی است که قادر است در مدت زمان یک دقیقه و در دمای 37 درجه سانتی گراد، یک میکرومول اسید گالاکتورونیک را از پلی گالاکتورونیک اسید آزاد نماید.

    با توجه به تعریف فوق، جهت بدست آوردن فعالیت انزایم، منحنی استاندارد آزمون DNS  رسم می‌گردد. برای رسم منحنی استاندارد، مقادیر مختلفی از گالاکتورونیک اسید (900 – 0 میکروگرم ) بصورت محلول تهیه کرده و از هر کدام به مقدار 5/0 میلی لیتر در لوله های آزمایش می ریزیم. به تمام لوله ها 5/0 میلی لیتر سود 5/0 نرمال اضافه کرده و بخوبی مخلوط می نمائیم. سپس به محتویات 200 میکرولیتر محلول معرف DNS  می افزاییم. حاصل را در آب جوش به مدت 10 دقیقه قرار می‌دهیم. پس از خنک شدن، در صورت لزوم نمونه ها را با آب مقطر رقیق کرده و جذب نوری نمونه ها بوسیله دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 550 نانومتر خوانده می شود. بدین ترتیب که ابتدا دستگاه با لوله اول که فاقد اسید گالاکتورونیک است کالیبره می شود و سپس جذب نوری  نمونه ها قرائت می‌شود. در نهایت با توجه به مقادیر حاصله منحنی استاندارد آزمون DNS را رسم می کنیم.

خداییش وبلاگم خیلی علمی شده!!!

/ 1 نظر / 37 بازدید
محسن

سلام ببخشید میخواستم بدونم شما دینیترو سالیسیلسک اسید رو با چه قیمتی گرفتید؟الان قیمتش دستتون نیست؟ مرسی با تشکر محسن اکبریان